干细胞因子在毛囊上皮细胞中的表达

　　第三军医大学学报1999年第21卷第12期

吕中法　刘荣卿　伍津津　唐书谦　叶庆佾

　　提　要　目的：为了解毛囊上皮细胞在体内是否表达干细胞因子(scf)。方法：本文采用免疫组化和原位杂交技术，对毛囊上皮细胞中的干细胞因子表达情况进行检测。结果：编码干细胞因子的基因在毛囊上皮中部的局限区域表达特别明显，在毛囊上下部位的上皮表达则明显减弱，二者之间有显著差异(p＜0.05)；而干细胞因子蛋白则在毛囊上皮细胞中普遍表达，说明干细胞因子在毛囊上皮中的表达，在分子和蛋白水平是有区别的。结论：毛囊干细胞可能定位于毛囊上皮的中部区域。

　　关键词：毛囊　干细胞因子

　　毛囊真表皮间相互作用的研究是毛囊细胞生物学研究的热点，细胞因子在介导真表皮细胞间的生物学活动中起重要作用［1］。干细胞因子(stem cell factor，scf)是近年来发现的一种与造血干细胞等多种细胞的生长发育相关的细胞因子，对角朊细胞、黑色素细胞的生长发育和色素合成等也具有重要的调节作用［2，3］。为了观察毛囊上皮细胞在体内是否表达scf，我们应用原位杂交和免疫组化技术，对正常人毛囊上皮细胞中的scf表达情况进行了检测。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本采集

　　取外观正常的枕部头皮，标本来自18～35岁肾移植用尸体头皮，共4例，男女各2例。头皮取下后迅速置冰瓶中送冰冻切片，切片厚4μm和20 μm2种，前者风干用于做免疫组织化学染色；后者用4%多聚甲醛固定，用于原位杂交分析。

　　1.2　scf cdna探针的制备

　　scf重组质粒由本科徐小珂博士惠赠。scf片断为0.5 kb。将重组质粒转染大肠杆菌，进行质粒扩增，碱变性提取质粒dna，用限制性内切酶ecor ⅰ和bamh ⅰ酶切质粒dna，电泳鉴定，电洗脱法回收cdna探针，用地高辛试剂盒(德国boehringer mannheim)标记scf cdna探针。

　　1.3　原位杂交

　　切片在4%多聚甲醛中固定2～4h，pbs漂洗，在2μg/ml的蛋白酶k中37℃30 min，pbs漂洗，把切片移入含0.5 μg/ml scf探针杂交液的ep管中，42℃20～24 h。杂交后依次用4×ssc、2×ssc、1×ssc、0.5×ssc和pbs漂洗，将切片移入1∶1　000的抗地高辛抗体反应液中，室温12 h，pbs、tsm1、tsm2依次漂洗。加入nbt/bcip显色4 h，终止显色，二甲苯透明、封片。结果判断：以rna酶预处理过的切片为阴性对照，胞浆出现淡蓝色颗粒为(+)，深蓝色颗粒(++)，紫蓝色颗粒为(+++)；计数：在×400显微镜下，于每个毛囊的上、中、下部各选择10个视野，计算每个视野的细胞数，共计10个毛囊，取其均值。

　　1.4　免疫组织化学染色

　　按s-p试剂盒(购自福建麦新生物工程公司)介绍的步骤进行。scf单抗由徐小珂博士惠赠。4μm厚的冰冻切片4℃丙酮固定10 min，scf单抗稀度为1∶80。dab显色。以pbs代替一抗作为阴性对照。结果判断：胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒(+)，棕色颗粒为(++)，褐色颗粒为(+++)，计数方法同原位杂交。

　　2　结果

　　2.1　毛囊上皮细胞的scf mrna原位杂交结果

　　4例标本正常头皮的切片中，scf mrna表达阳性，呈淡蓝色或蓝色颗粒，尤其在毛囊上皮中部的局限区域表达特别明显，呈++～+++，其它部位表达呈+或阴性，见图1。毛囊中部上皮细胞的scf mrna表达结果与毛囊上、下部有明显区别，见表1。阴性对照均无染色。

表1　毛囊上皮细胞scf mrna的表达情况(阳性细胞数)

　　tab 1　expression of scf mrna in epithelium of hair

　　follicle(number of positive cells)

*:p＜0.01 vs middle region

图1　干细胞因子在毛囊上皮细胞中的原位杂交结果　(×100)

　　fig 1　in situ hybridization of the gene encoded scf in the epithelium of hair follicle　(×100)

　　2.2　毛囊上皮细胞的scf蛋白e表达结果

　　4例标本正常头皮的全部切片其scf杂色均阳性，呈+～++，无明显局部表达增强的特征，见图2。阴性对照均无染色。

图2　干细胞因子在毛囊上皮细胞中的免疫组化染色结果　(s-p×200)

　　fig 2　results of expression of scf protein in tbe epithelium of hair follicle by immunocytochemistry　(s-p×200)

　　3　讨论

　　毛囊是一个具有生长、退行、休止3个阶段周期性循环的皮肤附属器，由上皮和真皮2部分组成。毛囊真表皮间相互作用在毛囊生长周期的调控中起重要作用。细胞因子是介导真表皮间的生物学活动的重要分子，很多研究显示egf、bfgf等细胞因子参与毛囊的发生、生长和生长周期的调控［4，5］。scf是近年来发现的一种与造血干细胞的增殖分化相关的细胞因子；并发现其对角朊细胞、黑色素细胞的生长发育也有明显的调控作用。本文检测了scf在毛囊上皮细胞中的表达情况，发现编码scf的基因在毛囊上皮中部的局限区域细胞表达特别强烈，明显强于其上下部位的毛囊上皮细胞，提示该部位部分毛囊上皮细胞表达scf mrna较强。文献［6］报道，小鼠毛囊干细胞位于毛囊的隆突部，而在人头皮，毛囊形态上无明显隆突部，通过克隆分析方法认为毛囊干细胞位于毛囊中部立毛肌附着处［7］。我们的结果是否对毛囊干细胞的定位具有提示作用，尚需进一步研究。

　　免疫组化染色结果表明，毛囊上皮细胞有比较一致的scf蛋白表达，无局部表达增强现象，说明毛囊上皮细胞中scf在分子和蛋白水平的表达是有区别的，grabble等［2］检测正常表皮角朊细胞的scf m-rna表达情况，发现正常角朊细胞有scf的表达，其中以基底细胞和棘层下部的角朊细胞表达较为明显。基底细胞是表皮的生发细胞，本文结果提示毛囊干细胞可能定位于毛囊上皮的中部区域。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500131)

　　foundation item: national natural science foundation of china(39500131)

　　作者简介：吕中法，男，1967.05.01生，浙江省永康县人，博士，主治医师，现在附属新桥医院皮肤科，主要从事毛囊重建方面的研究，发表论文8篇。电话：(023)68755687

　　作者单位：第三军医大学附属西南医院皮肤科，重庆 400038

　　参考文献

　　［1］　jahoda c a， reynolds a.dermal-epidermal interactions.adult follicle-derived cell populations and hair growth［j］.dermatol clin，1996，14(4):573-578.

　　［2］　grabbe j， welker p， rosenbach j， et al.release of stem cell factor from a human keratinocyte line， hacat， is increased in differentiating versus proliferating cells［j］.j invest dermatol，1996，107(2):219-222.

　　［3］　funasaka y， boulton t， cobb m， et al.c-kit-kinase induces a cascade of protein tyrosinephosphorylation in normal human melanocytesin response to mast cell growth factor and stimulates mitogen-activated protein kinase but is down-regulated in melanomas［j］.mol biol cell，1992，3(2):197-201.

　　［4］　peus d， pitteikow m r.growth factors in hair organ development and the hair growth cycle［j］.dermatol clin，1996，14(4):559-563.

　　［5］　rosenquist t， martin g r.fgf signaling in the hair growth cycle: expression of the fgf receptor and ligand genes in the murine hair follicle［j］.dev dyn，1996，205(4):379-382.

　　［6］　lavker r m， miller s， wilson c， et al.hair follicle stem cells: their location， role in hair cycle， and involvement in skin tumor formation［j］.j invest dermatol，1993，101(1 suppl):16s-19s.

　　［7］　rochat a， kobayashi k， barrandon y.location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis［j］.cell 1994，76(6):1063-1068.