郑业华 杨 恬 高强国 2005-12-13 13:00:58 中华实用医药杂志 2004年9月第4卷第17期

       【摘要】 目的 寻找不同发育阶段人毛囊-皮脂腺单位中C/EBPα和C/EBPβ的表达变化规律及与毛囊皮脂腺分化的关系。方法 应用免疫组化方法检测胚胎及新生儿和成人毛囊皮脂腺组织中C/EBPα和C/EBPβ的定位及表达。结果 C/EBPα和C/EBPβ分别在胚胎期毛囊外根鞘，毛乳头，毛母质及皮脂腺细胞的胞核内强表达;新生儿毛囊峡部下端外根鞘基底层细胞的胞核内也存在强表达，基底内层胞核阳性信号逐渐减弱;而成体毛囊核内阳性信号仅定位于峡部下端外根鞘基底层及皮脂腺基底层。毛囊外根鞘内层细胞随分化程度升高，胞浆内C/EBPα和C/EBPβ的表达逐渐升高，毛乳头细胞则未见阳性颗粒。在整个毛囊皮脂腺发育过程中C/EBPα的表达都略强于C/EBPβ。结论 C/EBPα和C/EBPβ在不同发育阶段的毛囊皮脂腺单位中均有表达，定位及表达水平与分化程度密切相关。

　　关键词 毛囊-皮脂腺单位 C/EBPs 分化

　　Characteristics of C/EBPs protein expressions in the pilo-sebaceous unit  of human at different developmental stage and 　　their biological significance 

　　Zheng Yehua，Yang Tian，Gao Qiangguo

     Department of Cell Biology，Third Military Medical University，Chongqing400038.

    【Abstract】 Objective To study the expression of C/EBPαand C/EBPβprotein in human piol-sebaceous uˉnit during different developmental stage.Methods C/EBPαand C/EBPβprotein expressions were studied by using immunohistochemical method.Results C/EBPαand C/EBPβexpressed differently in the outer root sheath，follicular papilla，hair matrix and sebaceous gland in embryonic period.The positive signals were chiefly distributed in the nucleˉuses.The expression of C/EBPαand C/EBPβwere found in the basal cell layer of outer root sheath and sebaceous gland in the new born and maturation phase，The expression in nucleuses of outer root sheat cells decreased with the differentiation but enhanced oppositely in the cytoplasm.Ngetive stain was in the follicular papilla.Conclusion They are expressions of C/EBPαand C/EBPβprotein in human pilo-sebaceous unit at different stage.The expression level is closely correlated with the differentiation degree.This indicates that C/EBPs play important roles in the development of human pilo-sebaceous unit.Key words human pilo-sebaceous unit C/EBPs differentiation  

　　C/EBPs蛋白是一组耐热的转录调控因子，能与启动子CCAAT区及多种病毒增强子结合，在细胞增殖、分化、信号转导及肿瘤发生、免疫反应、能量代谢等方面发挥重要作用。有实验表明C/EBP家族在细胞分化，炎症反应及基因调控中扮演了关键角色 ［1］  。C/EBPs存在于表皮中，与角质形成细胞分化及生长停滞有关 ［2］  。但它们与毛囊皮脂腺的关系却很少提到。我们检测了C/EBPα、C/EBPβ在人不同发育时期的毛囊皮脂腺单位中的分布与表达，探讨其与人毛囊皮脂腺单位生长发育的关系。

　　1 材料和方法

    1.1 材料 人胚胎（12～17周胎龄）、新生儿及成人正常头皮标本各5例，取自西南医院。标本去除皮下组织后立即用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水后切片备用。

    1.2 主要试剂 免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中山生物试剂公司，兔抗人C/EBPα和C/EBPβ单克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品。

    1.3 免疫组织化学 标本在冰冻切片仪上连续切片，片厚8μm，载于多聚赖氨酸包被的玻片上，冰冻切片完全烘干后，1%H 2 O 2 甲醇封闭内源性过氧化物酶30min后依次加入正常工作血清15min，一抗（1:100，4℃过夜），二抗，S-P/HRP复合物，上述步骤间均以PBS缓冲液振洗3次，5min/次，DAB显色，常规脱水，透明，中性树脂封片，倒置显微镜观察。

    1.4 结果判定 在400倍光镜下观察免疫组化结果，随机选取5个视野，每个视野均观察100个细胞，C/EBPα标记定位于细胞核和（或）浆内，呈棕黄色颗粒或均匀黄染。阳性判定标准按着色深度和范围分:强阳性（+++），阳性细胞数>70%;中度阳性（++），阳性细胞数占30%～70%;轻度阳性（+），阳性细胞数占10%～30%;阴性（-），未见细胞着色。C/EBPβ阳性判定标准同C/EBPα。

    2 结果

　　在胚胎期（embryo，E）毛囊包括bulge区、外根鞘（outer root sheath，ORS）、毛球部（hari bulb）及皮脂腺（sebaceous gland，SG）中都存在强烈的C/EBPα与C/EBPβ的表达，阳性信号主要定位于外根鞘角质形成细胞、毛母质（hair matrix，HM）细胞、毛乳头（dermal papilla，DP）细胞及皮脂腺细胞的胞核内。C/EBPα在新生儿（neonate，N）的毛囊主要表达在峡部下端外根鞘基底层细胞的胞核中，且在外根鞘内层细胞中核内阳性信号随细胞分化程度升高而减弱，毛乳头与毛母质细胞均呈中度阳性，同时皮脂腺细胞也存在C/EBPα强表达特别是其基底层细胞的胞核;C/EBPβ在毛球部表达呈弱阳性，在外根鞘呈中度阳性且主要表达在其基底层（图 1、2）。在成人（adult，A）毛囊E/EBPα与E/EBPβ的表达明显 减弱，阳性信号主要分布在毛囊峡部外根鞘角质形成细胞及毛球部的毛母质细胞的胞浆内，毛乳头细胞为阴性，皮脂腺基底层细胞的胞核呈强表达，同时在毛囊内层的胞浆表达量随细胞分化程度升高而增强（图3）。在整个毛囊发育过程中C/EBPα的表达都略强于C/EBPβ。ORS、HM、DP、SG胞核和胞浆中的表达程度见表1和表2。表1 C/EBPs在毛囊皮脂腺单位各类型细胞胞核中的表达(略）

　　3 讨论

　　C/EBP即CCAAT/增强子结合蛋白，得名于其具有激活特定基因DNA增强子CCAAT重复序列的功能，这种转录因子共有7种亚型α、β、δ、γCRP1等，它们的分子结构中含有一个碱性转录激活区和一个亮氨基酸拉链模体，可形成同源或异源二聚体，通过DNA结合区结合于靶基因的调控元件。C/EBPs以组织和阶段特异性方式表达，调控大量组织中的细胞分化，如肝、脂肪组织、血管细胞、内分泌腺。近来，有实验发现C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ在表皮中表达参与角质形成细胞分化和生长抑制，在表皮角阮细胞中C/EBPα和C/EBPβ能下调分化标记蛋白;外壳蛋白、角蛋白1和10的表达 ［3］  。还有实验证明C/EBPα和C/EBPβ在鼠的生长期毛囊的内、外根鞘、皮脂腺、bulge区，真皮乳头和毛母质细胞中均有表达 ［4］  ，说明它们参与了角质形成细胞的终末分化并调控毛发周期中重要基因的表达。在本实验中我们通过免疫组化研究了C/EBPα、C/EBPβ在人不同发育阶段的特异表达，了解其与人毛囊皮脂腺生长分化的关系。我们的实验结果发现C/EBPα和C/EBPβ在胚胎期毛囊发育阶段突出表达在bulge区（毛囊干细胞聚集区），外根鞘，毛乳头及皮脂腺细胞的胞核内，说明在毛囊上皮分化过程中基因的表达调控可能有C/EBP的参与，根据既往实验发现它们可能通过细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21（wafl/cipl）起作用 ［5］  ，p21（wafl/cipl）的表达能引起细胞周期G1期阻滞，促进细胞分化成熟。在p21上游存在有转录因子C/EBPα和C/EBPβ的DNA结合区，它们可能通过与p21结合，调节p21基因的表达，从而导致毛囊上皮细胞分化。同时我们的实验还发现在成体毛囊峡部以下球部以上外根    鞘角质形成细胞的胞核内C/EBP的表达较强，有文献报道 此处细胞表达上皮干细胞的标志蛋白K19，从而提出此处是除立毛肌附着处外另一个干细胞储蓄库 ［6］  。C/EBP在此处的表达进一步证实，C/EBP在低分化细胞的胞核内作用，激活转录使细胞停止增殖，转向分化。我们还发现随着毛囊外根鞘细胞逐渐分化，核内C/EBP表达水平逐渐减弱，胞内C/EBP表达水平逐渐增强，这也进一步证实了以前一些研究发现;C/EBP在维持细胞分化状态中起着重要作用。另外，我们发现C/EBPα、C/EBPβ在皮脂腺腺体边缘细胞的胞核中强表达。C/EBPα、C/EBPβ是控制脂肪细胞分化和脂质形成的重要因子，如果我们假设皮脂腺细胞分化和脂质形成的机制与脂肪细胞相似 ［7］  。那么C/EBPα、C/EBPβ也可能是调控皮脂腺细胞分化和脂质新陈代谢的重要因子。C/EBP蛋白对基因转录的调控是多层次、多因子、有一定时空次序的复杂精细调控，它们在毛囊皮脂腺分化过程中的作用研究仍然停留在初级阶段，它们与哪些因子协同作用?通过何种信号途径实现细胞间对话，调控毛囊皮脂腺中的基因转录?这些问题仍有待于进一步研究。（本文图片见封三）

　　参考文献

     1 Lekstrom-Himes J，Xanthopoulos KG.Biological role of the CCAAT/enhancer binding protein family of transcription factors.J Biol Chem，1998，273:28545-28548.

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    7 Rosenfield RL，Deplewski D，Kentsis A，et al.Mechanisms of androgen induction of sebocyte differentiation.Dermatology，1998，196:43-46. 

　　作者单位:400038重庆第三军医大学基础部细胞生物教研室

　　（收稿日期:2004-05-22）